怎么做好活体成像实验？
浏览量: 376发布时间：2019-07-26
导读：
活体成像技术能够让研究人员直接快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应。其特点是极高的灵敏度使微小的肿瘤病灶（少到几百个细胞）也可以被检测到，比传统方法的灵敏度大大提高了；非常适合于肿瘤体内生长的定量分析；避免由于宰杀老鼠而造成的组间差异；节省动物成本。那如何选择自己最合适的活体荧光成像系统呢？本文试从以下几点来进行分析。1、 荧光标记的选择
活体成像技术能够让研究人员直接快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应。其特点是极高的灵敏度使微小的肿瘤病灶（少到几百个细胞）也可以被检测到，比传统方法的灵敏度大大提高了；非常适合于肿瘤体内生长的定量分析；避免由于宰杀老鼠而造成的组间差异；节省动物成本。那如何选择自己最合适的活体荧光成像系统呢？本文试从以下几点来进行分析。
1、 荧光标记的选择
活体荧光成像技术主要有三种标记方法：荧光蛋白标记、荧光染料标记和量子点标记。荧光蛋白适用于标记肿瘤细胞、病毒、基因等。通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等。荧光染料标记和体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以标记抗体、多肽、小分子药物等。量子点标记作为一种新的标记方法，是有机荧光染料的发射光强的20倍，稳定性强100倍以上，具有荧光发光光谱较窄、量子产率高、不易漂白、激发光谱宽、颜色可调，并且光化学稳定性高，不易分解等诸多优点。量子点是一种能发射荧光的半导体纳米微晶体，尺寸在100nm以下，它可以经受反复多次激发，而不像有机荧光染料那样容易发生荧光淬灭。
但是不同荧光波长的组织穿透力不同，如图1所示，各种波长的光对小鼠各种器官的透过率，都在波长>600nm时显著增加。而如图2所示，在650nm-900nm的近红外区间，血红蛋白、脂肪和水对这些波长的光的吸收都保持在一个比较低的水平。因而，选择激发和发射光谱位于650nm-900nm的近红外荧光标记（或至少发射光谱位于该区间），更有利于活体光学成像，特别是深层组织的荧光成像。（推荐文献： Nature Method, 2005, 2: 12 如何选择合适的荧光蛋白； Science, 2009, 324: 804 钱永建教授研究成果-近红外荧光蛋白，非常适合活体荧光成像）。
2、 活体荧光成像CCD的选择
选择适当的CCD镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。如何选择活体荧光性价比最高的CCD呢？CCD有一些重要的参数：
1） CCD 像素。CCD像素决定成像的图片质量，像素越高，成像质量越好。由于荧光背景光较强，产生非特异性杂光干扰明显，需要配有高分辨率CCD的相机。
2） 前照式还是背照式CCD。一般而言，背照式CCD具有更高的量子效率，但是只有在检测极弱光信号优势明显（如活体生物发光成像），但在强光检测中与前照式CCD无本质差别，还更容易光饱和，并且其成本较高的弱势使其不属于荧光检测常规要素。
3） CCD 温度。制冷CCD分为两种：恒定低温制冷CCD和相对低温制冷CCD。恒定低温制冷CCD拥有稳定的背景，可以进行背景扣除；而相对低温制冷CCD由于背景不稳定，一般不能进行有效的背景扣除。CCD制冷温度越低，产生的暗电流越小，如图3所示，当制冷温度达到-29℃时，产生的暗电流已经低至0.03e/pixel/s。由于仪器自身产生的噪音主要由暗电流热噪音和CCD读取噪音组成，而目前CCD读取噪音最低只能降至2e rms；因而更低温度的CCD并不能明显的降低背景噪音，而成本却极大提高。
4） CCD 读取噪音和暗电流。CCD读取噪音和暗电流热噪音是成像系统产生背景噪音的主要因素，但是 在荧光成像中，最主要的背景噪音却是来自于荧光背景光。荧光成像信噪比的改善主要依赖于荧光背景光的有效控制和背景扣除技术（图4）。
3 、自发荧光的干扰
在活体荧光成像中，动物自发荧光一直困扰着科研工作者。在拥有激发光多光谱分析功能的活体成像系统出现以前，科学家们被迫采取各种方法来减少动物自发荧光，比如：采用无荧光素鼠粮饲养小鼠、使用裸鼠等。现在，拥有激发光多光谱分析功能的活体成像系统，能够轻松进行荧光信号的拆分，如图5，食物、膀胱、毛发和皮肤的自发荧光能够被有效的区分和剥离。激发光多光谱分析也可用于多重荧光标记检测，实现一鼠多标记，降低实验成本，并有效提高数据的可比性。
4、 荧光信号的准确定位
如图6所示，如果信号和靶标100%重合，这是科学家所追求的；但是，如果信号并不和靶标重合，而又误以为正确定位时，这是科学的噩梦。也许，一个错误定位的信号，比没有信号更加糟糕！
而同时拥有结构成像（如X光、MRI）和功能成像功能（如荧光、发光、同位素）的多功能活体成像系统，则让您摆脱困境，准确定位荧光信号。如图7所示，小鼠的X成像经过胃肠造影，可清晰地获得胃肠的形状和位置，将荧光信号和X光叠加，荧光和胃肠重合，可准确判定荧光定位在胃肠。
1、 荧光标记的选择
活体荧光成像技术主要有三种标记方法：荧光蛋白标记、荧光染料标记和量子点标记。荧光蛋白适用于标记肿瘤细胞、病毒、基因等。通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等。荧光染料标记和体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以标记抗体、多肽、小分子药物等。量子点标记作为一种新的标记方法，是有机荧光染料的发射光强的20倍，稳定性强100倍以上，具有荧光发光光谱较窄、量子产率高、不易漂白、激发光谱宽、颜色可调，并且光化学稳定性高，不易分解等诸多优点。量子点是一种能发射荧光的半导体纳米微晶体，尺寸在100nm以下，它可以经受反复多次激发，而不像有机荧光染料那样容易发生荧光淬灭。
但是不同荧光波长的组织穿透力不同，如图1所示，各种波长的光对小鼠各种器官的透过率，都在波长>600nm时显著增加。而如图2所示，在650nm-900nm的近红外区间，血红蛋白、脂肪和水对这些波长的光的吸收都保持在一个比较低的水平。因而，选择激发和发射光谱位于650nm-900nm的近红外荧光标记（或至少发射光谱位于该区间），更有利于活体光学成像，特别是深层组织的荧光成像。（推荐文献： Nature Method, 2005, 2: 12 如何选择合适的荧光蛋白； Science, 2009, 324: 804 钱永建教授研究成果-近红外荧光蛋白，非常适合活体荧光成像）。
2、 活体荧光成像CCD的选择
选择适当的CCD镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。如何选择活体荧光性价比最高的CCD呢？CCD有一些重要的参数：
1） CCD 像素。CCD像素决定成像的图片质量，像素越高，成像质量越好。由于荧光背景光较强，产生非特异性杂光干扰明显，需要配有高分辨率CCD的相机。
2） 前照式还是背照式CCD。一般而言，背照式CCD具有更高的量子效率，但是只有在检测极弱光信号优势明显（如活体生物发光成像），但在强光检测中与前照式CCD无本质差别，还更容易光饱和，并且其成本较高的弱势使其不属于荧光检测常规要素。
3） CCD 温度。制冷CCD分为两种：恒定低温制冷CCD和相对低温制冷CCD。恒定低温制冷CCD拥有稳定的背景，可以进行背景扣除；而相对低温制冷CCD由于背景不稳定，一般不能进行有效的背景扣除。CCD制冷温度越低，产生的暗电流越小，如图3所示，当制冷温度达到-29℃时，产生的暗电流已经低至0.03e/pixel/s。由于仪器自身产生的噪音主要由暗电流热噪音和CCD读取噪音组成，而目前CCD读取噪音最低只能降至2e rms；因而更低温度的CCD并不能明显的降低背景噪音，而成本却极大提高。
4） CCD 读取噪音和暗电流。CCD读取噪音和暗电流热噪音是成像系统产生背景噪音的主要因素，但是 在荧光成像中，最主要的背景噪音却是来自于荧光背景光。荧光成像信噪比的改善主要依赖于荧光背景光的有效控制和背景扣除技术（图4）。
3 、自发荧光的干扰
在活体荧光成像中，动物自发荧光一直困扰着科研工作者。在拥有激发光多光谱分析功能的活体成像系统出现以前，科学家们被迫采取各种方法来减少动物自发荧光，比如：采用无荧光素鼠粮饲养小鼠、使用裸鼠等。现在，拥有激发光多光谱分析功能的活体成像系统，能够轻松进行荧光信号的拆分，如图5，食物、膀胱、毛发和皮肤的自发荧光能够被有效的区分和剥离。激发光多光谱分析也可用于多重荧光标记检测，实现一鼠多标记，降低实验成本，并有效提高数据的可比性。
4、 荧光信号的准确定位
如图6所示，如果信号和靶标100%重合，这是科学家所追求的；但是，如果信号并不和靶标重合，而又误以为正确定位时，这是科学的噩梦。也许，一个错误定位的信号，比没有信号更加糟糕！
而同时拥有结构成像（如X光、MRI）和功能成像功能（如荧光、发光、同位素）的多功能活体成像系统，则让您摆脱困境，准确定位荧光信号。如图7所示，小鼠的X成像经过胃肠造影，可清晰地获得胃肠的形状和位置，将荧光信号和X光叠加，荧光和胃肠重合，可准确判定荧光定位在胃肠。
